Suzette Juárez Contreras
Francisco Héctor Chamorro Ramírez
Dulce María González López
Jaime Bustos Martínez
Introducción
La leche es un alimento que proporciona diversos nutrientes como vitamina B12, lípidos y carbohidratos, magnesio, calcio, selenio, riboflavina, ácido pantoténico y otros minerales. Es una fuente rica en proteínas de alta calidad debido a sus abundantes aminoácidos esenciales y posee una buena digestibilidad y biodisponibilidad (Du et al., 2022; Dash et al., 2022). Sin embargo, debido a su pH neutro y nutrientes, también es un medio ideal para el crecimiento bacteriano (Elegbeleye y Buys, 2020). En este sentido, la leche es estéril cuando proviene de la ubre de una vaca sana y el número de microorganismos en la leche suele ser bajo.
La contaminación ocurre por la higiene deficiente de la ubre y el pezón, del equipo de ordeño e incluso debido a los ordeñadores o manipuladores de la leche (Ndahetuye et al., 2020; Dash et al., 2022). Otra fuente importante de contaminación de la leche se asocia con biopelículas en las superficies de equipos de procesamiento, tales como en el equipo de ordeño, tanques de almacenamiento y en la boquilla de llenado (Pasvolzky et al., 2014; Dash et al., 2022; Elegbeleye y Buys, 2022). Las biopelículas les permiten a las bacterias contaminar la leche y en el caso de bacterias psicrótrofas, pueden producir enzimas que afectan la calidad de la leche. Además, aumentan la tasa de corrosión de las tuberías y equipos metálicos y reducen la transferencia de calor. Por lo tanto, la contaminación de leche debido a la presencia de biopelículas es una preocupación para la industria láctea, especialmente con las tendencias actuales de mayor producción, el uso de equipos complejos, la automatización de plantas y requisitos microbiológicos estrictos (Pasvolzky et al., 2014; Zhang et al., 2020).
¿Qué son las biopelículas y cómo se forman?
Las biopelículas son adherencias de células bacterianas que pueden formarse sobre caucho, polipropileno, plástico, vidrio, acero inoxidable y sobre los alimentos. Las células están protegidas por una matriz extracelular (MEC) formada por 90% de agua, sustancia polimérica extracelular (EPS), ADN y partículas incrustadas. Su composición y morfología varían, ya que una bacteria puede crear diversos tipos de biopelículas al exponerse a diferentes condiciones (Fysun et al., 2019).
La formación de biopelículas consta de cinco pasos (Figura 1). Inicia con la adhesión bacteriana, y es reversible porque la célula tiene movimiento browniano y puede desprenderse fácilmente de la superficie; la unión es causada por fuerzas de van der Waals, interacciones estéricas, electrostáticas e hidrofílicas. La segunda etapa es la adhesión irreversible, se involucran fuerzas de corto alcance entre los apéndices celulares y la superficie, interacciones dipolo-dipolo, puentes de hidrógeno y enlaces covalentes iónicos e hidrofóbicos; en esta etapa comienza la multiplicación celular y la producción de EPS. En la tercera etapa se forman microcolonias y hay una mayor producción de EPS que fortalece la interacción célula-sustrato. En la cuarta etapa se tiene la maduración donde las microcolonias se convierten en macrocolonias, aumentando la densidad de población. Finalmente, en la etapa cinco debido a la limitación de nutrientes y acumulación de ácidos y residuos, se da la dispersión de las células plantónicas que se desprenden de la biopelícula y pueden formar una nueva biopelícula (Fysun et al., 2019; Silva et al., 2022).
Figura 1. Etapas de la formación de biopelículas. Fuente: Elaboración propia.
Factores implicados en el desarrollo de biopelículas en la industria láctea
El desarrollo y supervivencia de las biopelículas se ven influenciados por propiedades de la bacteria (cepa y serotipo, MEC, flagelos, genes), superficie (hidrofobicidad, humectabilidad y rugosidad), industria (matriz alimentaria, protocolo de limpieza y desinfección, flujos laminares y turbulentos, material de construcción) y ambiente (pH, temperatura, humedad relativa, nutrientes, agua, minerales y presencia de otros microorganismos) (Hascöet, 2019; Fysun et al., 2019).
Los materiales de superficies industriales donde se han encontrado biopelículas son el acero inoxidable, aluminio, vidrio, politretrafluoroetileno, caucho de nitrilo y teflón. Sin embargo, el acero inoxidable es el más usado en la industria alimentaria y favorece la adhesión bacteriana y formación de biopelículas (Fysun et al., 2019; Silva et al., 2022). Aunado a ello, los exudados de leche con grasas, proteínas y carbohidratos favorecen la producción de biopelículas (Carrascosa et al., 2021).
Como se mencionó antes, la disponibilidad de nutrientes en el medio afecta el crecimiento de biopelículas; sin embargo, también se ha observado que las bacterias son capaces de formar biopelículas en entornos de nutrientes limitados en respuesta al estrés. En cuanto al pH, la densidad de las biopelículas es mayor a un pH más bajo debido a la coagulación de la proteína de la leche, y los posibles cambios fisiológicos dentro de las células bacterianas (Teh et al., 2014).
Por otro lado, la transferencia horizontal de genes permite su diseminación entre los miembros de la comunidad, como genes que codifican para resistencia antimicrobiana y capacidad metabólica o virulencia. Esto es gracias al Quorum sensing (QS) el cual es un mecanismo con el que las bacterias producen moléculas de señalización regulando la expresión de genes según la densidad de población. El QS se ha implicado en la tolerancia al estrés, producción de enzimas por psicrótrofos y en la regulación de actividades de deterioro de alimentos. La lactosa y proteínas de la leche también pueden desencadenar la formación de biopelículas y la regulación de QS en entornos lecheros (Yuan et al., 2019; Yuan et al., 2018).
Biopelículas en las superficies de la industria láctea
Los tanques de almacenamiento, silos de leche, exteriores de las bombas, paredes, tuberías de leche, zona de ultrafiltración y clarificación, intercambiadores de calor de placas y las unidades de llenado se clasifican como piezas de alto riesgo para la formación de biopelículas en la industria láctea (Fysun et al., 2019; Flint et al., 2020).
La leche cruda está en contacto con temperaturas superficiales de entre 5 y 72°C durante el calentamiento en el pasteurizador y en el enfriamiento posterior en el intercambiador de calor. En este sentido, la leche pasteurizada puede contaminarse con bacterias psicrótrofas que mueren durante la pasteurización, pero pueden entrar en el equipo de procesamiento por recontaminación. Esta recontaminación está asociada con la formación de biopelículas por psicrotrófos en el sistema de agua de enjuague, o en la línea de llenado que incluye las unidades de llenado y el llenador de los tanques de vacío o a granel (Fysun et al., 2019).
Psicrótrofos formadores de biopelículas
Los géneros de bacterias que se encuentran comúnmente en la leche cruda son diversos; sin embargo, bacterias psicrótrofas como Bacillus y Pseudomonas son dominantes en la leche debido a su capacidad para esporular y crecer más rápido que otras bacterias en bajas temperaturas (Elegbeleye y Buys, 2020). Estas temperaturas favorecen la producción de EPS y aumentan la formación de biopelículas por psicrótrofos, puesto que la MEC retiene enzimas, sustratos y brinda sitios de unión que facilitan las reacciones enzimáticas (Yuan et al., 2018). La retención de enzimas y otros metabolitos que facilitan la hidrólisis de moléculas complejas como los lípidos y las proteínas de la leche, provocan el deterioro y la reducción de la vida útil de la leche (Elegbleye y Buys, 2022). Estas enzimas pueden liberarse de las biopelículas a la leche sin desprendimiento bacteriano, de modo que la contaminación puede pasar desapercibida hasta que surjan problemas microbiológicos (Fysun et al., 2019). En general, se cree que tal producción de enzimas celulares es comúnmente mayor dentro de las biopelículas que en las células planctónicas de una cepa (Elegbleye y Buys, 2022).
Pseudomonas
Las especies del género Pseudomonas spp. se consideran los principales psicrótrofos aislados en leche. Crecen a temperaturas de entre 3 y 70°C, pero forman biopelículas por debajo de 10°C (Fysun et al., 2019; Dash et al., 2022). Las asociadas en el deterioro de leche incluyen P. brenneri, P. putida, P. koreensis y la dominante es P. fluorescens (Rather et al., 2021). En un estudio reciente de leche almacenada a temperaturas de 2 a 12°C, Pseudomonas representó la mayor proporción en todas las temperaturas y estuvieron presentes en niveles de abundancia >80% a 2 y 4°C (Du et al., 2022).
Pseudomonas producen una gran cantidad de EPS, se adhieren fácilmente al acero inoxidable y producen fimbrias de adhesión a diferentes temperaturas. Sus biopelículas están presentes en los tanques de almacenamiento de la industria láctea y pueden producir enzimas extracelulares termoestables (Fysun et al., 2019).
Bacillus
Los miembros del género Bacillus tienen la capacidad para sobrevivir a la desecación, desinfectantes y procesamiento térmico gracias a sus endosporas y a la formación de biopelículas (Elegbeleye y Buys, 2020). Las principales especies que se encuentran en la industria láctea son B. licheniformis, B. mycoides, B. cereus, B. subtilis y B. megaterium (Rather et al., 2021).
B. cereus, por ejemplo, es una bacteria formadora de esporas y tiene una alta capacidad de adherirse y formar biopelículas (Silva et al., 2022). Por su parte, B. subtilis y B. velezensis pueden secretar enzimas extracelulares tanto en biopelícula como en estados planctónicos de una manera que depende de la cepa en la leche y su potencial de formación de biopelículas (Elegbeleye y Buy, 2022).
Efectos de las enzimas sobre las propiedades de la leche
Las enzimas de microorganismos psicrótrofos alteran las propiedades fisicoquímicas de la leche y, en consecuencia, causa defectos en la funcionalidad y en sus propiedades sensoriales (Teh et al., 2014). Las principales enzimas de deterioro de la leche son las enzimas extracelulares, como proteasas y lipasas (Yuan et al., 2019).
Existen dos tipos de proteasas: las exopeptidasas (EC 3.4.11 y 19) que escinden en los extremos de las cadenas polipeptídicas y las endopeptidasas (EC 3.4.21-24 y EC 3.4.99) que escinden dentro de dichas cadenas (Baur et al., 2015). Las proteasas hidrolizan el enlace peptídico en k-caseína, causando la formación de para-k-caseína, seguido por β-caseína. Estas reacciones provocan la desestabilización y degradación de la micela, confiriendo un sabor amargo y la coagulación de la leche (Teh et al., 2014; Baur et al., 2015; Calvo, 2018).
Las lipasas son carboxilhidrolasas y se distinguen por la longitud de cadena de las acilgliceroles hidrolizados; se conocen dos tipos, las esterasas y lipasas auténticas. Las esterasas (EC 3.1.1.3) actúan sobre los triacilgliceroles de cadena corta (C<10), mientras que las lipasas auténticas (EC 3.1.1.3) hidrolizan triacilgliceroles de ácidos grasos de cadena larga (C>10). Cuando se hidroliza la grasa de la leche, se liberan ácidos grasos que provocan sabores desagradables, como rancios, jabonosos u ocasionalmente amargos en la leche. La mayoría de las lipasas en leche se producen durante la fase exponencial tardía o al comienzo de la fase estacionaria de crecimiento (Baur et al., 2015; Calvo, 2018).
Yuan et al. (2019) reportan que P. fluorescens produce altas concentraciones de lipasas a 25°C, lo que indica que el abuso de temperatura pre-pasteurización podría conducir a un mayor deterioro lipolítico de la leche. En un estudio reportado por Flint et al. (2020) obtuvieron 64 aislamientos de P. fluorescens de una industria láctea, donde el 89% pudo formar biopelículas a 10 y 30°C después de 48 h. En este sentido, se ha demostrado que las células de biopelículas aisladas de camiones cisterna producen más lipólisis de la leche cruda que las células planctónicas. Además, en condiciones simuladas de camiones cisterna, la proteólisis en leche UHT causada por la exposición posterior a biopelículas durante el transporte, fue mayor que para la no expuesta (Yuan et al., 2018; Yuan et al., 2019; Flint et al., 2020).
Zhang et al. (2020) obtuvieron 246 aislamientos de Pseudomonas, de los cuales 110 mostraron actividad proteolítica a 7°C: 94 de estos produjeron proteasas termoestables y 91 produjeron lipasas, de los cuales 81 fueron termoestables. Esto indica que las enzimas pueden descomponer la proteína de la leche y grasa durante el almacenamiento refrigerado antes del procesamiento. Además, recientemente se confirmó que la proteólisis y lipólisis de leche es mayor debido a biopelículas de B. licheniformis y P. fragi que a partir de células planctónicas (Elegbleye y Buys, 2022).
Control de biopelículas en la industria láctea
El control de biopelículas en la industria láctea implica la limpieza en el lugar (CIP) pero esto no las elimina debido a que exhiben mayor resistencia. Por ello se aumenta la frecuencia y el tiempo de limpieza. Una alternativa a la CIP es la combinación de dos o más estrategias, como desinfectantes químicos, enzimas y ultrasonido (Fysun et al., 2019; Wang et al., 2022). Para reducir la adhesión de P. aeruginosa y B. licheniformis, sin afectar las propiedades fisicoquímicas de la leche, se han probado superficies de acero inoxidable modificadas con recubrimientos a base de péptidos (Rather et al., 2021). En la tabla 2 se describen algunas de las opciones más utilizadas para el control de biopelículas en la industria láctea.
Conclusiones
Las especies del género Pseudomonas y Bacillus son las bacterias psicrótrofas comúnmente aisladas a partir de leche. Se confirma que las células de una biopelícula tienen la capacidad para producir más proteasas y lipasas que las células planctónicas. Esto indica que la leche que esté en contacto directo con biopelículas de bacterias psicrótrofas corre el riesgo de producir sabores amargos y rancios. Es indispensable contar con un adecuado protocolo de limpieza y desinfección, así como nuevas tecnologías para combatir el desarrollo de biopelículas que podrían afectar la calidad de la leche y, por ende, pérdidas económicas a la industria láctea.
Referencias
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Artículo publicado en Entorno Ganadero Octubre- Noviembre 2022
