Muestreo de Granos. Primera etapa para un correcto análisis de micotoxinas

César Mateo Flores Ortiz
Josefina Vázquez Medrano
Laboratorio de Biogeoquímica FES Iztacala, UNAM.

Martín Manzanares Gómez,
Angelina Pineda Mejía
División de Nutrición Animal
HELM de México, S.A.

Introducción

La producción avícola es una actividad pecuaria que en tiempos recientes ha alcanzado un desarrollo significativo, tanto en sus aspectos clínicos y zootécnicos, como en genética y nutrición. En particular en México, representa una de las actividades de producción de alimentos de origen animal más importantes, ya que se ha reconocido que nuestro país ocupa uno de los primeros lugares en el consumo de huevo en el mundo (UNA, 2010).

Los altos estándares de productividad que se requieren para esta industria se basan en una gran cantidad de elementos que participan en cada una de las etapas del proceso. La disponibilidad de granos y materias primas con cualidades nutricionales y de inocuidad, son el requisito primario en la producción de proteína animal. En este sentido, la presencia de micotoxinas producidas por el crecimiento de hongos miceliares, es un factor que provoca una gran preocupación en todos los niveles de la producción avícola integrada.

Tomando en cuenta lo anterior, los procedimientos para el aseguramiento de la calidad de los granos y raciones terminadas, en particular, con respecto a sus niveles de micotoxinas, es una práctica imprescindible para todos los productores avícolas. El establecimiento de un Plan de Análisis de Micotoxinas representa el marco de referencia para determinar con la mayor certidumbre posible la contaminación de materias primas y productos terminados.

Un Plan de Análisis de Micotoxinas contempla tres etapas principales en su definición, el muestreo, la preparación de la muestra y el método analítico. El muestreo representa la parte crítica de esta actividad debido a su complejidad y por la trascendencia en el resultado final para la correcta toma de decisiones.

Tomando en cuenta lo anterior, y dada la importancia de la correcta toma de muestras para un análisis de micotoxinas, en el presente trabajo se analizan los fundamentos teóricos y metodológicos del procedimiento para la colecta de muestras, así como, las recomendaciones que se deben seguir de acuerdo a las regulaciones vigentes a nivel nacional e internacional. Finalmente, se hace una revisión de las recomendaciones más prácticas para reducir los errores en el muestreo.

Muestreo de Granos. Primera etapa para un correcto análisis de micotoxinas muestreo granos micotoxinas 3Micotoxinas de Importancia en la Producción Avícola.

AFLATOXINAS

Las aflatoxinas son probablemente el tipo de micotoxinas más estudiadas en todos los aspectos, biológicos, toxicológicos y analíticos (Richard, L. 2007). Conforman un grupo de cerca de 20 compuestos que se caracterizan por la presencia de una funcionalidad química de difuranocumaronolactona que puede tener modificaciones dependiendo del origen biosintético y de las etapas de biotransformación durante su ingesta. La aflatoxina B1 es el compuesto más representativo de este grupo. Su efecto tóxico en aves está asociado con la interferencia de la replicación de los ácidos nucleicos, por lo cual, a niveles fisiológicos se caracteriza por la infiltración de grasa en el hígado, la presencia de hemorragias en el sistema gastrointestinal, la inmunosupresión y en casos severos de intoxicación, la muerte.

OCRATOXINA A

La Ocratoxina A pertenece a un grupo de micotoxinas nefrotóxicas que se caracterizan por la presencia de un anillo de isocumarina. En el caso de la Ocratoxina A, el anillo de la isocumarina se encuentra enlazado a través de una amida al amino de la fenilalanina, con lo cual, forma un pseudopéptido que interfiere de manera muy específica con la actividad de la fenilalanina-trasferasa. El efecto tóxico a nivel fisiológico en aves se refleja en una nefropatía aguda, donde los glomérulos se atrofian y se pierde la funcionalidad de la filtración glomerular (Stoev et al, 2002), causando una diarrea inespecífica que deshidrata al ave y reduce su capacidad para la absorción de nutrientes, medicamentos y pigmentos.

TRICOTICENOS

Los tricoticenos son un grupo extenso de micotoxinas que son producidos por hongos pertenecientes al género Fusarium. Este tipo de micotoxinas se caracteriza por la presencia de un anillo terpénico, el cual, en la mayoría de los casos presenta un epóxido de elevada reactividad que reacciona principalmente con proteínas, provocando un efecto de alquilación y desnaturalizando su estructura nativa. Entre los tricoticenos de mayor preocupación para la producción de aves se debe mencionar a la Toxina T2. La cual provoca a nivel fisiológico una serie de escoriaciones en los epitelios expuestos, tales como los paladares y el epitelio gastrointestinal. Las lesiones provocadas comúnmente se acompañan de infecciones oportunistas que proliferan en mayor medida debido a la inmunosupresión que se presenta por inhibición de la biosíntesis de inmunoglobulinas (Hussein y Brassel, 2001).

Fundamentos Estadísticos del Muestreo de Micotoxinas

Cuando se realiza el estudio del contenido de micotoxinas en un lote de granos o alimentos terminados, la pregunta de ¿cuál es el tamaño de la muestra? surge inmediata- mente al inicio del análisis. Lo anterior, se desprende del hecho de que una muestra demasiado grande represen- ta un desperdicio de recursos, tanto de los operarios del muestreo, como de los materiales retirados del proceso y una muestra pequeña no tiene valor práctico por la incertidumbre de su representatividad. Por lo tanto, para los planes de muestreo deben hacerse consideraciones estadísticas que aseguren la representación fiel de la variable de estudio, en este caso, las micotoxinas.

Así mismo, a partir de estudios realizados en la contribución de la varianza de cada etapa del análisis de micotoxinas, se ha establecido que el muestreo es el de mayor trascendencia en el resultado final, ya que contribuye con el 83% de la variación del resultado en un mismo lote (Withaker, T. 2001). Dicha variación está asociada a las concentraciones tan bajas requeridas para la contaminación y a la distribución heterogénea de la contaminación, en este sentido, Withaker (1974) ha demostrado en análisis de cacahuates contaminados con aflatoxinas que sólo el 0.1% de las semillas analizadas presenta la contaminación.

Para determinar el tamaño más apropiado de la muestra en el análisis de las micotoxinas, se han propuesto diversos enfoques que buscan armonizar las metodologías para elevar los niveles de precisión de los resultados y la concordancia entre laboratorios. Tomando en cuenta lo anterior, las recomendaciones generales del tamaño de la muestra se definen en función de tres variables principales, el coeficiente de confiabilidad esperado, la prevalencencia de la contaminación con micotoxinas y la precisión que se puede aceptar en el estudio.

Con relación al coeficiente de confiabilidad, se recomienda el nivel del 99% (2.56 en la distribución normal), el cual es el mínimo aceptable para reducir el error tipo II que se refiere a no rechazar una hipótesis nula falsa (Daniel, 2004), lo cual representa el riesgo de aceptar un lote contaminado por arriba de los límites permisibles. Este es el riesgo de mayor preocupación para los productores por los problemas asociados a los síndromes de intoxicación. Así mismo, es más conveniente disminuir el riesgo de aceptar un lote contaminado comparado con el riesgo de rechazar un lote sin contaminaciones.

Por otro lado, la prevalecencia de micotoxinas, que debe entenderse como el porcentaje esperado de muestras contaminadas, es el parámetro más difícil de definir, ya que este es precisamente el resultado que se espera del estudio, por lo cual, en sí mismo es un sinsentido, sin embargo, el valor puede plantearse en términos de una hipótesis a demostrar y así tiene un planteamiento técnico aceptable. Adicionalmente, un rango aproximado de prevalecencia se puede establecer con la experiencia del comportamiento de las contaminaciones y con base en estudios de ocurrencia natural de micotoxinas. En el grupo de trabajo de la FES Iztacala, se han realizado diversos estudios de ocurrencia natural, analizan- do granos y materias primas empleadas en la producción pecuaria (Flores et al, 2006; Flores et al, 2011), con lo cual, se han establecido valores aproximados de porcentaje de muestras con niveles detectables de micotoxinas y porcentaje de muestras contaminadas con valores superiores a las normas establecidas. A partir de los resultados obtenidos, sabemos que en general se presenta un 65% de muestras positivas con micotoxinas y alrededor de un 15% de muestras con niveles arriba de las regulaciones. Por tanto, un valor de prevalecencia de 15% está sustentado y tiene concordancia con los valores reportados para otros países en América y Europa (Fink-Gremmels, 1999; Russell et al., 1991).

Finalmente, la precisión del muestreo se refiere a la reproducibilidad del mismo muestreo, es decir, la probabilidad que se espera al realizar repeticiones del muestreo de un lote y se tenga el mismo resultado. Los niveles de precisión que se permiten son de 90%, ya que un incremento de 5% en el rigor de la precisión se traduce en un incremento de tres órdenes de magnitud en la cantidad de muestras a analizar.

Tomando en cuenta los parámetros descritos es posible hacer un ejercicio del cálculo del tamaño de muestra, aplicando la siguiente fórmula:Muestreo de Granos. Primera etapa para un correcto análisis de micotoxinas muestreo granos micotoxinas 2

Suponiendo que el tamaño de los lotes es infinito y que la extracción sucesiva de muestras no afecta la probabilidad de otras muestras, se tienen los siguientes cálculos:

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El resultado obtenido se eleva al número entero inmediato superior dando 84 muestras para una población infinita, lo cual corresponde en forma muy cercana a las 100 muestras que recomienda la regulación europea para lotes mayores de 1500 toneladas (CE No. 401/2006) y con la regulación mexicana con las 100 muestras para lotes de 2000 toneladas (NOM-188 -SSA1-2002).

Debe aclarase que se considera una muestra a cada alvéolo de las zonas de muestreo, es decir una zona con 10 alvéolos recupera diez muestras. Así mismo, la totalidad de la muestra obtenida se homogeniza y se cuartea para obtener al final una muestra consolidada de 5 kg, la cual es empleada en los análisis instrumentales de micotoxinas.

Regulaciones de Muestreo para Análisis de Micotoxinas en México.

La Norma Oficial Mexicana NOM-188-SSA1-2002 define los tamaños de lotes y los procedimientos generales para la toma de muestras y análisis de Aflatoxinas. Más específicamente, para la producción avícola se ha propuesto el Proyecto de Norma Oficial “Límites Máximos Permisibles de Micotoxinas en Granos de Cereales y Alimento Terminado para Consumo de Aves”, el cual está en plena concordancia con la NOM-188-SSA1-2002 con respecto a los procedimientos de muestreo.

Las regulaciones vigentes establecen como primera etapa del muestreo el reconocimiento de los puntos calientes en los lugares de almacenamiento, o bien cuando no se tienen, se deben obtener de los registros históricos. Esta etapa es de importancia, ya que, los diseños de los silos y la orientación que tienen con respecto al oriente-poniente, determinan la creación de microambientes de temperatura y humedad diferenciales a lo largo de la superficie del silo o bodega que favorecen el crecimiento de hongos y la acumulación de micotoxinas. Por lo cual, el diseño de la estrategia de muestreo debe incluir en su cobertura, la toma de muestras en tales puntos calientes.

La segunda etapa del muestreo contemplada en la Norma Oficial es la definición del tamaño del lote, el cual depende del tipo de almacenamiento o de su estado de movimiento.

Para el almacenamiento a granel en bodegas o a la intemperie, la Norma Oficial establece un tamaño máximo del lote de 2000 toneladas, del cual se debe obtener una muestra compuesta para el análisis de micotoxinas. Dicha muestra no debe ser menor a 5 kg y en función del almacenamiento en bodegas o en silos, debe obtenerse de puntos de muestreo distribuidos homogéneamente de acuerdo a la Figura 1:

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Así mismo, la Norma Oficial establece el número de extracciones para cada punto de muestreo en función de la altura del volumen almacenado, de acuerdo a la Tabla 1.

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En aquellos casos de almacenes o silos donde el diseño y la cobertura no permitan la extracción de muestras de acuerdo a la distribución recomendada, se deberán obtener las muestras a partir de las escotillas o termopares laterales que se tengan dispuestos en los silos.

Con relación al muestreo en cereales almacenados en costales, la Norma Oficial dispone un diseño de colecta de muestras a través de una “M” trazada en las estibas (Figura 2), de tal forma que la amplitud de la “M” no sea mayor de 5 m en su parte inferior y que el número de costales muestreados corresponda a los establecidos en la Tabla 2.

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Por otro lado, con relación al muestreo de cereales en transportes, la Norma Oficial, establece que para contenedores de hasta 30 toneladas deben colectarse 7 muestras y para contenedores con capacidad mayor a 30 toneladas deben colectarse 10 muestras. Los puntos de muestreo que se recomiendan son los que se ilustran en la Figura 3.

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Adicionalmente, la regulación vigente prevé la posibilidad del muestreo en movimiento, en el cual los granos se encuentran desplazándose debido a las operaciones de carga, descarga y movimientos de transferencia entre silos. En este caso la Norma Oficial dispone la colecta de una muestra primaria de 500 g por cada 12.5 toneladas de grano hasta obtener una muestra compuesta de 5 kg.

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El muestreo en movimiento es sin duda la forma más práctica y eficiente para la obtención de una muestra representativa, sin embargo, para el caso particular de análisis de micotoxinas, se debe tener en cuenta que los granos contaminados disminuyen su densidad debido al agotamiento de sus contenidos de grasas y azucares, por lo cual, su desplazamiento es diferenciado con respecto a granos íntegros. Así mismo, se debe contemplar que las mayores contaminaciones con hongos y micotoxinas se presentan en las fracciones de finos y barreduras, los cuales sólo se pueden registrar en el proceso de mezclado gradual que se observa en las condiciones de almacenamiento a granel.

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Las regulaciones establecidas en la Norma Oficial NOM-188-SSA1-2002, indican que no tienen concordancia con regulaciones internacionales; sin embargo, es conveniente revisar las disposiciones de tamaños de lote y número de muestra elementales para consolidar muestras primarias de acuerdo a la normatividad en la Comunidad Europea establecida en el Reglamento (CE No. 401/2006), las cuales se resumen en la Tabla 3. A partir de la inspección de los lotes definidos en la Normatividad Europea se puede establecer que tienen equivalencia con las recomendaciones sobre el muestreo para granos a granel en almacén o en silos, donde la normatividad nacional recomienda lotes de 2000 toneladas y una muestra compuesta de 5 kg, la normatividad europea recomienda sublotes de 500 toneladas y muestras compuestas de 10 kg. Es evidente que la exhaustividad del método europeo rinde una mayor representatividad del lote; sin embargo, los costos de muestreo y los análisis incrementan la operatividad de esta regulación.

Recomendaciones Finales para el Muestreo de Granos.

Dado que el muestreo representa la mayor fuente de error en el análisis de micotoxinas, es conveniente revisar cuáles son las recomendaciones más prácticas para disminuir la varianza de los resultados, tomando en cuenta para estas recomendaciones el costo y el tiempo que representan para el análisis.

Entre las prácticas que más impactan para disminuir el error, se recomienda incrementar el tamaño de la submuestra, de tal forma que con el mismo número de extracciones se obtiene mayor volumen que puede ser reducido al momento del cuarteo. Por otro lado, al momento de la preparación de la muestra consolidada de laboratorio, es conveniente reducirla mediante la molienda, lo cual, reduce el tamaño de la partícula para el análisis y en sí mismo es un proceso adicional y eficiente de homogenización de la muestra.

Por otro lado, la asignación previa de los puntos de muestreo y el apego riguroso a ese diseño determinan una mayor representatividad de los lotes. Asimismo, en los casos donde sea posible se debe incrementar el número de extracciones, ya que se ha establecido que al incrementar las muestras al doble, se disminuye la varianza a la mitad.

Adicionalmente, en los casos donde las recibas de grano se hacen en trasportes, se recomienda identificar los sublotes que provienen del mismo origen para consolidar un lote de mayor tamaño en las bodegas y así aplicar el criterio de almacenamiento a granel.

Finalmente, con base en la experiencia personal se sugiere que el muestreo en movimiento sólo se aplique en aquellos lotes que tienen porcentajes bajos de granos quebrados, ya que, la distribución y el movimiento de los granos contaminados no siguen la misma dinámica del resto de granos íntegros.

REFERENCIAS

•CE No 401/2006. Métodos de muestreo y de análisis para el control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios.

•Daniel W. Bioestadística. Base para el análisis de las ciencias de la salud. Editorial Limusa. 2004.

•Flores, Ortiz, CM., Hernández, LB., Vázquez, J. 2006. Contaminación con micotoxinas en alimentos y granos de uso pecuario en México en el año 2003. Técnica Pecuaria en México 44:247-256.

•Flores-Ortiz, C.M., Hernández-Portilla, L.B., Manzanares-Gómez, M.D. 2011. Ocurrencia natural de mico- toxinas en granos y alimentos de uso pecuario en México en los años 2007-2009. Los Porcicultores y su Entorno. Año 14, No. 83: 106-110.

•Fink-Gremmels, J., 1999. Mycotoxins: their implications for human and animal health. Veterinary Quarterly 21, 115–120.

•Hussein, H.S., Brasel, J.M., 2001. Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on humans and animals. Toxicology 167, 101–134.

•NOM-188-SSA1-2002, Productos y Servicios. Control de aflatoxinas en cereales para consumo humano y animal. Especificaciones sanitarias.

•Richard, J.L. 2007. Some major myco- toxins and their mycotoxicoses—An overview. International Journal of Food Microbiology 119: 3–10.

•Russell, L., Cox, D.F., Larsen, G., Bodwell, K., Nelson, C.E., 1991. Incidence of molds and mycotoxins in commercial animal feed mills in seven midwestern states 1988–1989. Journal Animal Science. 69, 5–12.

•Stoev, T., Djuvinov. D., Mirtcheva, T., Oavlov, D., Mantle, P. 2002. Studies on some feed additives giving partial protection against ochratoxin A toxicity in chicks. Toxicology Letters 135: 33–50.

•Withaker, T.B. 2001. Standardization of mycotoxins sampling procedures: an urgent necessity. Food Control. 14: 233-237.

•Withaker, T.B., Dickens, J.W., Monroe, R.J. 1974. Variability of aflatoxin test results. Journal of American Oil Chemists Society. 51:214-218.

•UNA. Unión Nacional de Avicultores. 2010. Compendio de indicadores económicos. www.una.org.mx.

Artículo publicado en Los Avicultores y su Entorno

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