Alejandro Córdova Izquierdo.
Departamento de Producción Agrícola
y Animal. Universidad Autónoma
Metropolitana Unidad Xochimilco.
[email protected]
Alejandra Berenice
Galarza Ballesteros
Estudiante de MVZ-UAM-Xochimilco.
RESUMEN
La biotecnología para la selección del sexo en la porcicultura ha sido innovadora para los agricultores que desean que las crías sean de un sexo en particular. El uso de semen sexado para la inseminación artificial y la fertilización in vitro, cuyo resultado es el nacimiento de animales del sexo deseado con una probabilidad de 90%. El método de Citometría de Flujo para el sexado del semen es actualmente el más utilizado para el sexado de los espermatozoides. El contenido de ADN de los espermatozoides que contienen cromosoma X y Y es diferente, el X contiene más ADN, la diferencia se refleja en el grado de intensidad cuando se realiza la tinción con ácido nucleico de fluorescencia y es aplicable para fraccionar cada tipo de espermatozoide. Los espermatozoides separados según su cromosoma X o Y, usando Citometría de Flujo, está basado en el grado de diferentes intensidades de fluorescencia, los que reflejan más intensidad, mayor será su contenido de ADN. En este trabajo se hace una breve revisión sobre el sexado de espermatozoides, importancia de esta biotecnología en la producción porcina, el uso de semen sexado como una nueva biotecnología innovadora y eficaz para la producción de cerdos.
INTRODUCCIÓN
La demanda de productos pecuarios como carne y leche han ido en aumento a nivel mundial en los últimos años, para satisfacer esta demanda se ha comenzado a implementar nuevas tecnologías modernas para promover la producción sostenible de animales. La producción en porcinocultura mediada por espermatozoides o embriones, junto con otras tecnologías genómicas, proteómicas y fenómicas, ofrece una estrategia de reproducción prometedora para satisfacer la mayor demanda de producción de alimentos.
El control de la proporción de sexos implica retornos directos en el sector de la porcinocultura, que permite una mayor gestión de la producción de alimentos, la mejora de bienestar animal, una selección genética más rápida y una disminución de impacto ambiental.
La tecnología de semen sexado es una buena herramienta que actualmente está disponible con alta precisión y repetibilidad para obtener mejores beneficios para las granjas porcinas. El uso del semen sexado para Inseminación Artificial y fertilización in vitro da como resultado el nacimiento de animales con sexos deseados. La determinación del sexo en la etapa temprana puede reducir el costo a través del manejo selectivo de verracos genéticamente superiores.
Los instrumentos con alto índice de clasificación y precisión sin dañar los espermatozoides aceleran aún más el progreso de estas nuevas tecnologías. Un método como la citometría de flujo para el sexado de espermatozoides es actualmente el método más utilizado. El cual evalúa la calidad, estructura, función y motilidad del esperma luego de ciclos de congelación y descongelación, valorar daños en el esperma y su calidad para la fertilización.
En este trabajo se hace una breve revisión bibliográfica sobre el uso de semen sexado como una nueva tecnología innovadora y eficaz para las granjas porcinas.
IMPORTANCIA EN REPRODUCCIÓN PORCINA
Inseminación artificial
La inseminación artificial (IA) ha contribuido a los avances en los programas de cría y producción debido a la facilidad de acceso y la capacidad de los machos para producir altas tasas de gametos, la IA ha sido el enfoque principal de las tecnologías reproductivas. Actualmente es una de las técnicas mayormente utilizadas en las granjas a nivel comercial porque ha tenido grandes beneficios en la rapidez del mejoramiento genético. Esto se ha venido logrando con verracos de alta calidad genética incrementando el número de hembras servidas con semen sexado (Roca et al., 2006). Siendo así la mayor ventaja de la IA, ya que hace el uso máximo de sementales. La industria de la IA ha crecido enormemente, la primera inseminación exitosa se realizó en un perro en 1784.
En los últimos 100 años, también se utilizó para fines de estudio en conejos, perros y caballos. La primera vez que se utilizó la IA como una práctica de procedimiento en animales de granja fue por Ivanow en el siglo XX (Foote, 2002). Este autor indicó que la IA es una de las biotecnologías que ha sido aceptado en todo el mundo y ampliamente utilizada para mejorar la reproducción y la genética de los animales de granja. Todas las demás técnicas asociadas, como congelación de semen sexado y sincronización está asociado al semen sexado, se establecieron después del gran éxito de la IA. Estas técnicas se encontraron para aumentar la eficiencia de la IA. Por ejemplo, la sincronización del estro se combina regularmente con IA. Sin la detección correcta del estro, la eficiencia de la IA es baja. Sin embargo, cuando la sincronización del estro se implementa, la eficiencia de la IA se incrementa y ya no es necesaria la detección del celo. Se ha informado que varias técnicas de reproducción artificial podrían ser la causa de la regulación epigenética anormal, pero los hallazgos a este tema siguen siendo limitados (Kremenskoy et al., 2006). No obstante, la tendencia actual en las industrias de IA es la mejora de la fertilidad, longevidad y la rentabilidad en animales de granja a través de un énfasis sobre los rasgos no productivos. Además, el linaje puro de razas y aplicando programas de cruzamiento para superar la endogamia se ha considerado la solución (Funk, 2006).
Fertilización in vitro
La fertilización in vitro con semen sexado depende de las cualidades del ovocito e igualmente de los espermatozoides utilizados. Por lo tanto, después de la maduración, los ovocitos son expuestos a los espermatozoides para producir la fecundación como ocurre en forma fisiológica, las células espermáticas deben alcanzar su capacidad fecundante, a través de un proceso de preparación in vitro con objeto de iniciar su capacitación o desencadenar la reacción acrosomal (Thedy, 2012).
La heparina ocupa un papel fisiológico importante en la capacitación y espermática usada durante el proceso in vitro, desencadena la capacitación y finaliza con la reacción acrosómica, permitiendo la penetración del espermatozoide en la zona pelúcida.
La técnica de selección y preparación de espermatozoides (swin up e gradiente de Percoll) tiene el objetivo de separar los espermatozoides del líquido seminal y del diluyente y así obtener espermatozoides con un mínimo de 70% de motilidad progresiva. Los ovocitos y espermatozoides son incubados en un medio específico, por un periodo de aproximadamente 18 horas a temperatura de 39°C en atmósfera de 5% de CO2 en una cámara saturada (Thedy, 2012). Los posibles cigotos son transferidos a un medio de cultivo donde permanecerán hasta adquirir el estado de blastocisto.
Las condiciones de cultivo pueden influenciar las cualidades de los embriones y envolver factores como medio, atmósfera gaseosa, densidad, presencia o no de un medio de cultivo y algún tipo de suplementación proteica. Los medios simples como fluidos de oviducto sintético (SOF) puede ser substituido por un co-cultivo en un medio enriquecido de células somáticas (Thedy, 2012).
La utilización de semen sexado en la producción in vitro de embriones permite disminuir el tiempo en el que se logran determinados objetivos. Los resultados que se obtienen son variables, diversos investigadores han efectuado estudios tendientes a mejorar las tasas de división y la calidad embrionaria. Los aspectos que se han tenido en cuenta son: maduración de los ovocitos, proceso de sexado, concentración espermática, cultivo de los embriones y criopreservación de los mismos (Thedy, 2012).
NUEVAS BIOTECNOLOGÍAS
Para satisfacer la alta demanda de productos cárnicos se ha implementado la utilización de tecnologías modernas para promover la producción sostenible de animales. La producción ganadera mediada por espermatozoides o embriones, junto con otras tecnologías genómicas, proteómicas y fenómicas, ofrece una estrategia de reproducción prometedora para satisfacer la mayor demanda de producción de alimentos (Rath et al., 2013). Entre estos, el esperma sexado o el semen sexado es una de estas tecnologías reproductivas más nuevas disponibles (Bhalakiya et al., 2018).
El sexaje de espermatozoides en la especie porcina, al igual que en otros mamíferos, está basado en la técnica cuantitativa de citometría de flujo. La mayor desventaja de esta técnica es la relativa baja eficiencia para producir suficientes espermatozoides sexados para la IA, lo cual ha promovido la búsqueda de enfoques diferentes en el proceso de sexaje y selección (Naniwa et al., 2018). En estos casos pequeños desarrollos requieren de enormes inversiones y de la puesta en marcha de una complicada logística para llevar la nanotecnología al ámbito práctico del mercado porcino. Sólo empresas globales han sido capaces de impulsar los proyectos de investigación necesarios, que llevarán a los productores de porcino a poder seleccionar el sexo de sus producciones, como sucede en la industria de vacuno hoy en día (Rath et al., 2016).
Semen sexado
El semen sexado podría considerarse como el último avance en la reproducción animal, y el proceso de comercialización que ha ganado recientemente más impulso. El semen sexado se puede fertiliutilizar para producir descendencia del sexo deseado, y por lo tanto podría ser de valor para mejorar la eficiencia de la producción de animales genéticamente superiores (Seidel Jr., 2012; Boro et al., 2016). A pesar de la ventaja de la predeterminación de sexo en la rentabilidad, en general es de poco valor para aumentar la tasa de mejora genética. El aumento de la proporción de un sexo en comparación con otro no funciona para mejorar el mérito genético de los animales, aunque se incrementa el tamaño de muestra de los candidatos de selección. Además, la tecnología es obstaculizada por factores tales como menores tasas de gestación, así como altos costos (Garrick
y Ruvinsky, 2014).
BENEFICIOS DEL SEMEN SEXADO
Existen algunos beneficios del semen sexado entre los cuales podemos encontrar:
- La determinación del sexo en la etapa más temprana puede reducir el costo del manejo selectivo de animales de costos superiores.
- Se puede producir animales del sexo deseado.
- Reduce el costo de los programas de prueba de progenie y la transferencia de embriones, aumenta el valor de los marcadores genéticos.
- Se usa menos cantidad de esperma sexado en hembras genéticamente superiores para el reemplazo (Bhalakiya et al., 2018).
DESVENTAJAS DEL USO DE SEMEN SEXADO
El uso de semen sexado también tiene desventajas que cuestionan la implantación del mismo. Entre las más importantes incluyen de la disminución de la tasa de concepción, debido a la baja dosis de espermatozoides de las pajuelas y al efecto que genera el proceso de sexado sobre los espermatozoides (Urbina, 2012), y el costo por pajuela el cual es mayor que el semen convencional como consecuencia del valor asociado a los equipos, licencias, fabricación, mano de obra altamente calificada, comercialización, distribución y entrega. Estos costos se transmiten a la industria de mayores precios para el semen sexado (De Vries, 2010).
La utilización de semen sexado implica un perfecto manejo de semen, la inseminación artificial, condiciones y técnica de descongelado para obtener buenos resultados del programa de inseminación (Urbina, 2012).
Se debe de tener en cuenta que la presión de selección intensa puede disminuir la variabilidad genética de la población, hecho que podría aumentar la consanguinidad (Urbina, 2012).
FERTILIDAD Y TASA DE CONCEPCIÓN
Diferentes investigaciones han demostrado que el uso de semen sexado disminuye las tasas de concepciones frente al semen convencional (Cabrera, 2010).
Comparado al semen convencional, se ha reportado una baja fertilidad debido principalmente a la baja eficiencia de la selección espermática mediante el método de flujo citométrico, siendo la concentración espermática de semen sexado de 2,1 millones de espermatozoides, mientras que el semen convencional tiene una dosis de 15 a 20 millones de espermatozoides (Garner y Seidel, 2008). Cabe destacar que la fertilidad también se ve reducida empleando dosis más elevadas (diez millones), en comparación con la fertilidad media obtenida con la misma dosis de semen no sexado (DeJarnette et al., 2009).
Los bajos porcentajes de fertilidad están relacionados no solo con la baja concentración espermática empleada en la dosis, sino también con los daños en el ADN (Arruda et al., 2012). La fragmentación en el ADN espermático, tiene un impacto negativo sobre la fertiliutilizar dad (diferencias individuales), aunque en la infertilidad, son más importantes los cambios en la condensación de la cromatina espermática (Paniagua, 2013).
Se han propuesto varios factores para explicar la reducción en las tasas de fertilidad, entre los que se encuentran la baja dosis de espermatozoides usada, el daño espermático causado por el procedimiento de separación, el tiempo transcurrido desde el proceso de sexado hasta la inseminación y el estado reproductivo del animal (DeJarnette et al., 2011).
MUERTE EMBRIONARIA Y ABORTOS
En cuanto a la muerte embrionaria y los abortos relacionados con semen sexado no se encuentra en la bibliografía referencia, solo un trabajo en ovinos que muestra un aumento de abortos en aquellos animales inseminados con semen sexado, y un comentario en un trabajo que aclara que el porcentaje de abortos en semen sexado no muestra diferencias en comparación con el semen convencional (Seidel, 2007).
PRESELECCIÓN DEL SEXO MEDIANTE SEPARACIÓN ESPERMÁTICA
Existen estudios en los cuales se probaron distintas técnicas para clasificar los espermatozoides que llevan cromosoma Y X durante 20 a 30 años. Todas estas técnicas se basan principalmente en muchas diferencias teóricas en el cromosoma Y X, como en los mamíferos, el cromosoma X contiene más ADN que el cromosoma Y. El grado de diferencias varía de una especie a otra (Johnson y Welch, 1999).
MÉTODOS DE SEPARACIÓN ESPERMÁTICA
Se han realizado varios intentos, en muchas partes del mundo, para desarrollar métodos que separen de manera eficiente el semen en fracciones que contienen concentraciones más altas de esperma con X o Y. El único método que ha demostrado ser comercialmente viable es la citometría de flujo. Sin embargo, la presión de clasificación, la velocidad, la desviación eléctrica, la radiación láser dan como resultado una alta alteración de la membrana y una precapacitación. Todos estos cambios en el esperma clasificado conduce a una fertilidad reducida. No obstante, el desarrollo del instrumento para aumentar la tasa de clasificación y la pureza sin afectar la viabilidad y la fertilidad sigue siendo una área activa de investigación (Prakash et al., 2014).
Este método se basa en las diferencias entre los espermatozoides que llevan Y y X en la capacidad de nadar en una solución de degradado. Como los espermatozoides que llevan Y son más pequeños
CITOMETRÍA DE FLUJO
La citometría de flujo es una herramienta de análisis de laboratorio que se empezó a usar a principios de los años 50´s con el fin de contar y analizar células sanguíneas. En veterinaria es relativamente reciente usada por una amplia gama de disciplinas para analizar y separar poblaciones celulares (Córdova et al., 2016). Su uso en reproducción animal es principalmente la correlación que existe entre la concentración, viabilidad del esperma y la fertilidad. Evalúa la calidad, estructura, función y motilidad del esperma luego de ciclos de congelación/descongelación (Laguado, 2007). Los citómetros de flujo son los clasificadores de células avanzados que utilizan el láser para excitar el tinte fluorescente que se une al ADN y el colorante específico de ADN son el principio principal para el sexado de espermatozoides a través de citometría de flujo (Prakash et al., 2014).
En este método de clasificación, los espermatozoides son teñidos previamente con un colorante como bisbenzimidazol (Hoechst 33342) que es permeable a las membranas de espermatozoides vivos e intactos y se une al ADN. Estos espermatozoides se transportan a un punto donde se exponen individualmente a un rayo láser UV, se detecta y se analiza la fluorescencia azul brillante emitida (Seidel, 2007). Las gotas son cargadas positiva o negativamente y son desviadas por una placa con la carga opuesta de manera que el esperma es dirigido a un vaso colector para cada una y el desecho a otro (espermatozoides muertos y/o no reconocidos). Se pueden producir unas 6 a 8 dosis inseminantes, de aproximadamente 2’000.000 de espermatozoides, por hora, con una eficacia promedio del 90% del sexo deseado (Ferré & Cattaneo, 2013), además de que no contiene espermatozoides muertos o dañados y se puede utilizar en inseminaciones artificiales, fertilizaciones in vitro y transferencia embrionaria.
En todos los espermatozoides sexados producidos en la actualidad independientemente de la especie, son usando estos instrumentos y protocolos de citometría de alta velocidad (Rath et al., 2009).
Entre los diversos métodos, la separación basada en citometría de flujo de espermatozoides específicos del sexo es el más utilizado y a comparación de otros métodos ya que es el que ha demostrado ser más eficaz para producir descendientes del sexo previsto hasta la fecha.
El semen sexado se presenta comercialmente congelado, en pajuelas de 0,25 ml. Las mismas contienen 2 a 10 millones de espermatozoides. La dosis menor se utiliza normalmente en inseminación artificial y fertilización in vitro, y la mayor en transferencia de embriones. La velocidad de separación que se utiliza actualmente permite obtener 7 pajuelas de 2 millones de espermatozoides X e igual número de Y por hora (Pérez, 2009).
Para controlar la calidad del semen, se descongela una pajuela por partida y se evalúa la motilidad progresiva y la pureza (proporción del sexo deseado) de las dosis producidas. Las mismas deben tener un mínimo de 35% de espermatozoides con motilidad progresiva y 85% de certeza del sexo para alcanzar los estándares de aprobación (Pérez, 2009).
LIMITANTES DEL PROCESAMIENTO DE SEMEN MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO
Las limitaciones pueden deberse a diferentes etapas del nivel de procesamiento, del equipo, el procedimiento de clasificación, las técnicas de inseminación o la capacidad de fertilización del semen sexado (Seidel, 2007).
- El costo del equipo y su tecnología patentada son altos.
- Alto costo de mantenimiento.
- Requieren mano de obra calificada para la operación y supervisión de la máquina.
- Proceso lento (menos cantidad de espermatozoides) (menos pajuelas).
- La mitad de la muestra de espermatozoides es viable y lo demás es desperdicio.
- La eficiencia del sexado es mejor con los espermatozoides frescos.
Recientemente, se ha encontrado que el paso del espermatozoide a través de un campo electrostático afecta a las mitocondrias espermáticas. La microscopía electrónica de transmisión muestra claros daños en las crestas mitocondriales causados por despolarizaciones de membrana y por especies oxígenoreactivas, lo cual disminuye la vida del espermatozoide (Klinc & Rath, 2007; Rath et al., 2013). Hay nuevos antioxidantes que podrían contribuir a mejorar las características de motilidad tras el sexaje, prolongando la vida útil del espermatozoide hasta un valor más normal (Xia et al., 2012). Además, se han encontrado factores específicos en el espermatozoide de porcino perjudiciales para el sexaje.
Alkmin et al. (2014) encontró que los eyaculados de aproximadamente el 15% de los verracos no son adecuados para el sexaje. Aquellos verracos cuyos eyaculados sí podían ser sexados mantuvieron esta capacidad durante los 5 meses que duró el estudio. Más aún, si se reducía la presencia de plasma seminal al 0% o 10%, un período de incubación de 24 h antes de su sexaje no afectaba a este proceso ni al almacenamiento posterior, mientras que la presencia del 50% de plasma seminal reducía la eficiencia del sexaje, pero no el almacenamiento posterior líquido (Alkmin et al., 2014). Una alternativa para incrementar la velocidad del sexaje sería el desarrollo de microfluídica, técnica emergente que no sólo emplea conocimiento
de citometría de flujo, sino además provee de un escenario nuevo para aplicaciones hidrodinámicas. Si el principio de diferenciación cuantitativa del ADN será el elegido, o si habrá otros métodos más eficientes, el impacto del uso paralelo de chips y microfluidos será de gran impacto.
FACTORES QUE AFECTAN A LOS ESPERMATOZOIDES DURANTE EL PROCESO DE SEXADO
Una de las causas del daño espermático, que disminuye la capacidad fecundante junto con alteraciones en los embriones (Palma, 2007), podría deberse a la combinación del colorante y a la energía láser, empleados en la separación. Factores de estrés, problemas en la manipulación de la máquina o del semen, desde la extracción hasta la congelación, podrían conducir a contaminaciones, como complicaciones accesorias a la técnica. La solución de los factores que causan estrés espermático no alcanzarán a incrementar capacidad fecundante del semen si el personal responsable de su manipulación varía ampliamente en su grado de capacitación profesional, destreza y entrenamiento (Seidel, 2007).
FERTILIZACIÓN IN VITRO Y TÉCNICAS RELACIONADAS PARA PRODUCIR CAMADAS CON SEMEN SEXADO
Sólo son necesarios unos pocos espermatozoides para realizar fertilización in vitro (IVF) con oocitos madurados in vivo o in vitro. Los primeros embriones de IVF con espermatozoides sexados de verracos fueron producidos hace 23 años. En estos experimentos tempranos se recolectaron complejos oocito-cúmulus de cerdas prepuberales superovuladas, poco después de su ovulación. Noventa y dos embriones producidos de células espermáticas sexadas X fueron transferidos quirúrgicamente a dos recipientes. Las hembras parieron 10 hembras saludables (Rath et al., 1993). En posteriores experimentos usando espermatozoides sexados (mediante alta velocidad) en dosis frescas, se obtuvieron camadas de IVF usando oocitos madurados in vivo e in vitro (Rath et al., 1997, 1999; Aberydeera et al., 1998). Otro enfoque puede ser la transferencia de gametos intra-falopio (GIFT) en la que oocitos maduros y esperma sexado se depositan juntos en una pajuela de plástico, y son transferidos en los oviductos de cerdas periovulatorias. Comparando el GIFT con esperma no sexado y sexado, 50% y 48% de óvulos recuperados habían evolucionado a blastocistos con 25-80 células (Rath et al., 1994). Existe otra técnica que requiere incluso de menos espermatozoides. La inyección espermática intracitoplasmática ha venido usándose para producir camadas de machos usando un solo espermatozoide sexado por ovocito (Probst & Rath, 2003). Sin embargo, excepto para el GIFT, todas estas técnicas in vitro sólo serían aceptables para la industria si permitieran una transferencia embrionaria no quirúrgica. El prerrequisito es un sistema eficiente para producir embriones hasta fase mórula o blastocisto in vitro.
Los instrumentos de transferencia y las técnicas adecuadas han sido desarrolladas por Roca et al. (2003 y 2011) y Krisher & Wheeler (2010), los cuales han desarrollado un sistema casi automático para la producción in vitro con chips en microfluidos. Por lo tanto, es muy probable que en un periodo aceptable de tiempo, se encuentre disponible en el mercado un sistema de producción avanzada de embriones combinado con un sistema de transferencia no quirúrgica, usando semen sexado.
BENEFICIOS DEL SEMEN SEXADO EN LA PRODUCCIÓN PORCINA
El uso del semen sexado trae consigo ciertas ventajas con respecto al semen convencional, como el aumento de nacimientos de crías de sexo deseado. Esto lleva a una reducción del costo de reposición, el cual es de alta incidencia en la rentabilidad de las empresas, sumando a la posibilidad de crecimiento de la explotación con reemplazos propios, reduciendo así la posibilidad de introducir enfermedades graves y costosas a la granja (Velazco, 2002).
El uso de semen sexado ha demostrado ser efectivo para aumentar la proporción de sexos deseada. Esto plantea la cuestión de si el semen sexado es beneficioso para la administración de la granja. En general, se espera que el uso de semen sexado tenga un efecto positivo en la economía de las granjas.
CONCLUSIÓN
Los mejores resultados de la utilización del semen sexado se consiguen en cerdos con una salud reproductiva excelente, así mismo la utilización de semen sexado genera una mayor cantidad de animales con sexo deseado lo cual permite incrementar los ingresos a las explotaciones dedicadas con algún fin en el campo de la reproducción. La técnica de citometría de flujo permite separar los espermatozoides X de Y con una confiabilidad cercana al 90% lo que garantiza con precisión el sexo esperado. En la actualidad, los avances del semen sexado presentan resultados inferiores en comparación con el semen convencional, tanto en inseminación artificial, transferencia embrionaria y fertilización in vitro. Sin embargo, el sexado de espermatozoides en el área de la porcicultura representa una alternativa viable para optimizar las eficiencia reproductiva y
productiva de los cerdos.
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Artículo publicado en Los Porcicultores y su Entorno Septiembre- Octubre 2020
