Historia de las micotoxinas

PhD Dr. Alexandros Yiannikouris

No debería sorprender que las micotoxinas se hayan convertido en una grave preocupación desde los años 60, junto con el descubrimiento de las aflatoxinas; sin embargo, ejemplos del impacto de las micotoxinas a lo largo de la historia de la humanidad, han demostrado que han sido una amenaza desde los inicios de la producción agrícola[1]. Por ejemplo, algunas referencias al ergotismo en el Antiguo Testamento[2] sugieren que las toxinas del Fusarium, tales como la toxina T-2 y la zearalenona, pudieran ser responsables del derrumbamiento de la civilización Etrusca y de la crisis ateniense ocurrida en el Siglo Quinto A.C.[4].

CONTROL DE LAS MICOTOXINAS

Con la finalidad de crear conciencia y en base al número cada vez mayor de trabajos recientes que se concentran en estrategias para brindar un control de las micotoxinas a diferentes niveles de la cadena del alimento humano y animal, es importante darse cuenta de que las micotoxinas representan un riesgo inevitable. Se necesitan entonces herramientas analíticas que funcionen como “radares de vigilancia” selectivos y establezcan la necesidad de retirar el material riesgoso. Determinar la presencia de micotoxinas es primer paso para desarrollar métodos de protección adecuados y esto exige mejores métodos de muestreo y de medición de las micotoxinas.

Debido a los efectos perjudiciales que producen las micotoxinas en los alimentos y en los cereales forrajeros, se ha regulado estrictamente el nivel de algunas micotoxinas en las muestras de alimentos y forrajes, oscilando para la mayoría de ellas entre ìg/kg y mg/kg. El reto fundamental para desarrollar procedimientos analíticos es la diversidad de moléculas de micotoxinas (actualmente se han identificado alrededor de 500) y cada una de ellas acusa una toxicidad e impacto económico diferente. Más aún, la contaminación por micotoxinas depende de condiciones ambientales que favorecen el crecimiento de hongos y desencadenan la síntesis de micotoxinas, Por estas razones es necesario poner en práctica técnicas adecuadas que permitan identificar a las micotoxinas a partir de múltiples matrices, lo cual a su vez también afecta la extracción de las micotoxinas y genera micotoxinas enmascaradas [5,6].

La gran diversidad química de los metabolitos del hongo puede traducirse en múltiples estructuras químicas que podrían encontrarse en un extracto de muestra, lo cual dificulta la búsqueda y permitiría que se cometan errores.

PRUEBAS PARA DETECTAR MICOTOXINAS

La primera herramienta de evaluación de los alimentos y del forraje sería la observación de signos de contaminación, bien sea visualmente o mediante análisis cuantitativo de los hongos. Sin embargo, estas evaluaciones no se correlacionan bien con la presencia de micotoxinas y nos queda sólo el análisis de las micotoxinas (quimotaxonomía), como herramienta para tamizajes de alto rendimiento basados en la identificación de los hongos. No obstante, la complejidad de este método plantea un desafío debido a la variabilidad del patrón de síntesis de micotoxinas en el ambiente. También hay técnicas más complejas que pueden usarse para diferenciar indirectamente las cepas de hongos toxigénicos de los atoxigénicos, eliminando los metabolitos volátiles. Esto se hace generalmente mediante el uso de cromatografía de gas, combinada con detección por espectrometría de masa [7] o, más recientemente, con el desarrollo de una nariz electrónica [8].

La correcta evaluación de los niveles de micotoxinas se relaciona estrictamente con la selección adecuada de muestras representativas, lo cual sólo puede lograrse recolectando más muestras y de mayor tamaño. Se ha estimado que el tamaño adecuado de la muestra puede ser entre 1,25 a 10,0 kg, de acuerdo con la matriz del alimento y se necesitaría homogenizar posteriormente entre 50 a 100 muestras en submuestras de 62,5 a 500 g.

El tamaño de la muestra debe ser homogéneo entre ellas, con una variación de peso de máximo ± 5% [9]. No importa lo que pase, una parte de los lotes buenos serán eventualmente rechazados por el plan de muestreo y viceversa, una parte de los lotes malos serán aceptados por el plan de muestreo (riesgo del vendedor/comprador o falsos negativos). La magnitud de estos riesgos se relacionan directamente con la magnitud de la variabilidad asociada al procedimiento de la prueba para micotoxinas. Este método es aún más complicado debido a las diferencias en las reglamentaciones de los distintos países que sostienen intercambio comercial.

Los errores relacionados con el muestreo pueden ser de hasta un 80%, con 10% correspondiente a sub-muestreo y error durante el análisis de la preparación de la muestra menor a 10% [10].

Para ser eficiente y evitar errores en la detección de micotoxinas es necesario hacer referencia a los principios del aseguramiento de calidad. El análisis debe entonces hacerse con cierto grado de incertidumbre. Algunas técnicas de muestreo, si se llevan a cabo de manera inadecuada, afectarán el muestreo e inducirán además a errores dramáticos en el análisis final. Por lo tanto, la capacitación del personal pareciera ser obligatorio para prevenir efectos secundarios relacionados con las técnicas de muestreo y sub-muestreo disponibles, dependiendo del producto básico. Así, el paso de pre-tratamiento de las muestras deberá evitar imprecisiones mediante la utilización de instrumentos y herramientas adecuados. Finalmente, el procedimiento analítico deberá realizarlo un técnico debidamente capacitado. Es importante que en los ensayos se utilicen materiales de referencia adecuados y certificados, junto con un método de análisis validado, a fin de garantizar resultados finales de buena calidad [11].

Por una parte, la detección rápida y sensible utilizando pruebas de tamizaje que sean costo-efectivas y fáciles de utilizar están a la disposición de todo el mundo en el campo. El inconveniente es la falta de selectividad, la reactividad cruzada [12] y fluctuación de la respuesta de acuerdo con la variación de las condiciones ambientales cuando se aplican en situaciones de campo (pH, temperatura, efectos de la matriz y competencia, etc.) [13]. Además se requiere confirmación con un método más sofisticado capaz de mostrar la especificación y cuantificación precisas de las micotoxinas.

SENSORES Y BIOSENSORES

Como herramientas de tamizaje, el método basado en inmuno-ensayos, utiliza anticuerpos desarrollados específicamente para detectar micotoxinas. Esta elevada especimicotoxificidad está relacionada con la homología entre la cavidad o el sitio activo que ofrecen los anticuerpos (el epítope) para un substrato (la micotoxina). Este enfoque tiene el inconveniente de la reactividad cruzada a la cual ya se hizo referencia, a la luz de la presencia de análogos en la matriz.

Esos ensayos semi-cuantitativos o cualitativos pueden ser de naturaleza diferente: radioactivos en el caso de inmunoensayos radioactivos (IRA); fluorogénicos en inmunoensayos fluorescentes (IEF); o cromogénicos en el caso de inmunoensayos enzimáticos (IEE, ELISA).

Con frecuencia se elige a ELISA como parte de los planes para el control de las micotoxinas, debido a su velocidad y a la gran cantidad de muestras que pueden analizarse permitiendo la semi-cuantificación o una respuesta de si / no a ciertos niveles y rangos de concentración. Otras estrategias son el uso de dispositivos de flujo lateral, tales como inmuno-tiras e inmuno-filtración, con anticuerpos inmovilizados en su superficie. También existen sensores y biosensores que utilizan anticuerpos, enzimas, bacterias, receptores, ADN o transducción de una señal detectable en forma óptica o electroquímica (utilizando resonancia de plasmón superficial, espectroscopia infrarroja). Estas técnicas pueden rápidamente probar granos para los principales grupos de micotoxinas reguladas dentro de límites de detección razonables, dentro del rango de 0,5 a 20 ìg/kg, pero es preciso usarlas con precaución, nuevamente debido a la reactividad cruzada y a los falsos positivos

Como herramienta de tamizaje, la cromatografía en capa fina (CCF) puede aplicarse de igual forma que ELISA, con mejor repetibilidad y menos reactividad cruzada, pero requiere limpieza adicional de la muestra y en consecuencia aumenta el tiempo necesario para obtener un índice preciso. Los nuevos enfoques emergentes se concentran en el uso de la genómica y la transcriptogenómica como herramientas para el análisis de micotoxinas. Estas tecnologías utilizan la capacidad de la célula viva para responder a la presencia de químicos, dejando huellas específicas a manera de expresión genética, de acuerdo con su tipo. Tales tecnologías podrían convertirse en nuevas herramientas de tamizaje, con el desarrollo de microchips de ADN que evaluarán el perfil de expresión genético ante la presencia de micotoxinas extraídas del forraje o de los alimentos [14].

HPLC

En segundo lugar, y para hacer frente a la amplia gama de estructuras químicas, la mayoría de los otros métodos se basan en cromatografía líquida (HPLC). La cromatografía líquida de alto rendimiento (o cromatografía líquida a alta presión) se utiliza para separar, identificar y cuantificar compuestos de acuerdo con sus propiedades químicas. LaHPLC utiliza una columna que incluye un elemento cromatográfico (fase estacionaria), una bomba que mueve la fase o las fases móviles a través de la columna y un detector que indica los tiempos de retención de las moléculas. El tiempo de retención varía dependiendo de las interacciones entre la fase estacionaria, las moléculas que se están analizando y el o los solventes utilizados. Los análisis de HPLC siguen siendo la “norma de oro” para la detección de micotoxinas por su confiabilidad y los bajos límites de detección y cuantificación que pueden lograr. Sin embargo, aun cuando definitivos, dichos métodos implican un proceso complicado y engorroso de extracción y limpieza, y un incremento consecuente de los costos.

Aun cuando los procedimientos preliminares de limpieza y concentración permiten menores límites de detección, su limitación estriba en los procedimientos específicos de extracción y detección, y en las condiciones de análisis que suelen estar relacionadas con una micotoxinas en particular (Ej., DON, Toxina T-2) o con una familia de micotoxificidad fluorescencia; de lo contrario, requerirá además derivación de la muestra. Otros desafíos estriban en los niveles de recuperación, la estabilidad de los derivados y la superposición de los compuestos sometidos a elusión. Por lo tanto, es necesario un abordaje de multi-componentes para la detección rápida de múltiples analizados, adecuada para diversas matrices.

La espectrometría de masa (MS) bidimensional, acoplada a cromatografía de separación, se está convirtiendo en un nuevo método de referencia para el análisis de las micotoxinas. Este enfoque permite la especiación a través de la masa atómica de todos los elementos presentes en una muestra y una clara asignación de micotoxinas luego de experimentos de fragmentación de patrón específico. Si bien es cierto que muchos componentes tienen el mismo valor de masa intacto, agregar otra dimensión a través de un fragmento (MS en tandem) permite la determinación de la huella específica de cada analizado investigado. La cuantificación es posible gracias al monitoreo específico de múltiples fragmentos iones a lo largo de un tiempo de elución cromatográfico. Finalmente, los análisis crecen en sensibilidad y precisión [17]. La adición de un paso cromatográfico permite la elución tiempo-dependiente de todas las especies, sugiriendo además la detección multi-componentes de micotoxinas en una misma muestra.

Hay factores limitantes en la supresión de la eficacia de la ionización debido a la matriz y a la inmensa diversidad de micotoxinas que pueden encontrarse, además de la falta de un calibrador. Trabajos recientes han permitido detectar y des-replicar casi 500 metabolitos fúngicos distintos, aparte de ofrecer sólo resultados cualitativos [18]. Otro aspecto interesante del enfoque LC-MS es la posibilidad de trabajar directamente con extractos crudos, usualmente obtenidos después de la extracción de la muestra con solventes y filtración básica, lo cual permite acelerar significativamente el análisis.

Hay otras tecnologías disponibles, pero probablemente menos populares que las técnicas expuestas anteriormente. Puede utilizarse la electroforesis capilar, junto con detectores fluorescentes y detectores UV, de la misma forma que HPLC. La espectrometría de movilidad de los iones y la espectrometría de movilidad iónica de forma de onda – espectrometría de masa – son otros de los métodos disponibles para el análisis de trazas de micotoxinas [15].

El enfoque de espectrofotometría de masa, debido a interfases recientemente desarrolladas y a la miniaturización de sus componentes, está ahora disponible como dispositivo para usarlo sobre el tope del banco de pruebas de casi todos los laboratorios de análisis. Debido a sus capacidades de multi-detección, su calidad, velocidad, confiabilidad y costo, esta herramienta también está disponible en el campo, como parte de las herramientas analíticas que pueden usar directamente los fabricantes de alimentos y forrajes. Finalmente, la rápida aplicación de esta tecnología a una infinita cantidad de contaminantes (Ej., pesticidas melamina…) o análisis de componentes esenciales, lo hace sumamente versátil.

CONCLUSIÓN

La complejidad de la labor de detección de micotoxinas se hace evidente por los numerosos métodos utilizados de manera más o menos efectiva para analizar su presencia, reconocida por el número de técnicas disponibles. Los obstáculos para su uso y aplicación son también muy amplios en razón de las propiedades inherentes a las micotoxinas, de su diversidad química y su transformación metabólica en otras especies moleculares. La complejidad de su interacción con matrices plantea otra limitación. En este sentido, se pueden encontrar micotoxinas como metabolito conjugado con uno o varios glucósidos o residuos glucurónidos, enmascarando las micotoxinas para que no puedan ser detectadas, aun cuando se utilice un procedimiento analítico. La constante evolución de los dispositivos analíticos y de los procedimientos de extracción, ayudará a mitigar los errores y a entender mejor, predecir y detectar la presencia de micotoxinas en el campo.

REFERENCIAS

1. Pittet A, Natural occurrence of mycotoxins in foods and feeds – an update review, Rev. Med. Vet. (1998), 149, 479–4922. Schoental R, Mycotoxins and the Bible, Perspect. Biol. Med. (1984), 28,117–120.
2. Schoental R, Mycotoxins and the Bible, Perspect. Biol. Med. (1984), 28,117–120.
3 Schoental R, Mycotoxins, porphyrias and the decline of the Etruscans, J. Appl. Toxicol. (1991), 11, 453–454.
4. Schoental R, Mycotoxins in food and the plague in Athens, J. Nutr. Med. (1994), 4, 83–85.
5. Berthiller F, Dall’Asta C, Schumacher R, Lemmens M, Adam G, Krska R, Masked Mycotoxins: Determination of a Deoxynivalenol Glucoside in Artificially and Naturally Contaminated Wheat by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, J. Agric. Food Chem. (2005), 53, 3421-3425.
6. Zhou B, Li Y, Gillespie J, He GQ, Horsley R, Schwarz P, Doehlert matrix design for optimization of the determination of bound deoxynivalenol in barley grain with trifluoroacetic acid (TFA), J. Agric. Food Chem. (2007), 55, 10141-10149.
7. Demyttenaere JCR, Morina RM, Sandra P, Monitoring and fast detection of mycotoxin-producing fungi based on headspace solidphase microextraction and headspace sorptive extraction of the volatile metabolites. J. Chromatogr. A (2003), 985, 127-135.
8. Presicce DS, Forleo A, taurino AM, Zuppa M, Siciliano P, Laddomada B, Logrieco A, Visconti A. Response evaluation of an E-nose towards contaminated wheat by Fusarium poae fungi. Sens. Act. B (2006), 118, 433-438.
9. Pitchford JB, USDA Grain Inspection Handbook. United States Department of Agriculture Grain Inspection, Packers and Stockyards Administration Federal Grain Inspection Service Program Handbook – Book1 (1995).
10. Whitaker TB, Johansson AS, Slate AB, Sampling Feeds for Mycotoxin Analysis – Book/Chapter. (2005) pp. 1-23.
11. Brera C, Miraglia M. Quality Assurance in Mycotoxin Analysis. Microchem. J. (1996), 54, 465-471
12. Erbs M, Hartmann N, Bucheli TD, Determination of the cross-reactivities for alpha-zearalenol, beta-zearalenol, zearalanone, alphazearalanol, and beta-zearalanol on three commercial immunoaffinity columns targeting zearalenone. J. AOAC Intern. (2007), 90, 1197–1202.
13. Schneider E, Curtui V, Seidler C, Dietrich R, Usleber E, Märtlbauer E, Rapid methods for deoxynivalenol and other trichothecenes. Toxicol. Lett. (2004), 153, 113–121.
14. Nageli H, Transcriptomics as a tool for the determination of trichothecenes. World Mycotoxin Forum, the 5th Conference – Abstract book (2008), pp. 60
15. Cigic IK, Prosen H, An overview of conventional and emerging analytical methods for the determination of mycotoxins. Int. J. Mol. Sci. (2009), 10, 62-115.
16. Maier NM, Buttinger G, Welhartizki S, Gavioli E, Lindner W, Molecularly imprinted polymer-assisted sample clean-up of ochratoxin A from re wine: merits and limitations. J. Chromatogr. B (2004), 804, 103-111.
17. Berthiller F, Schumacher R, Buttinger R, Krska R, Rapid simultaneous determination of major type A- and B-trichothecenes as well as zearalenone in maize by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A (2005), 1062, 209-216.
18. Nielsen KF, Smedsgaard J, Fungal metabolite screening: database of 474 mycotoxins and fungal metabolites for derplication by standardized liquid chromatography-UV-mass spectrometry methodology. J. Chromatog. A (2003), 1002, 111-136.18. Nielsen KF, Smed gaard J, Fungal metabolite screening: database of 474 mycotoxins and fungal metabolites for derplication by standardized liquid chr matography-UVmass spectrometry methodology. J. Chromatog. A (2003), 1002, 111-136.

Artículo publicado en Entorno Ganadero

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