Efecto de un probiótico sobre la colonización de salmonella enteritidis en pollos de engorda y sus parámetros leucocitarios
Jaime de Jesús Delgado Machuca
Departamento de Producción Avícola, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad de Colima. [email protected]
Omar Francisco Prado Rebolledo
Departamento de Producción Avícola, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad de Colima.
Rafael Julio Macedo Barragán
Luis Jorge García Márquez
Centro Universitario de Investigación y Desarrollo Agropecuario. Universidad de Colima.
Eduardo Morales Barrera
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco.
Guillermo Téllez Isaías
Billy Hargis
Department of Poultry Science, University of Arkansas,
Memorias, 8a Reunión AVEM. Queretaro, Méx. Marzo 2015.
RESUMEN
El objetivo fue determinar el efecto del probiótico Bacillus subtilis sobre la colonización de Salmonella enteritidis y sus parámetros leucocitarios en pollos de engorda, se utilizaron 60 pollos de engorda recién nacidos de la línea Cobb. Todos fueron oralmente desafiados con 106 ufc/S. enteritidis, el tratamiento A o control no recibió el probiótico, el tratamiento B se desafió con 106 ufc/B. subtilis en 1 mL por vía oral administrada con aguja esofágica cada 24 h durante tres días.
A las 72 h después de la administración del probiótico se tomó 1 mL de sangre de 10 aves de cada tratamiento y se sacrificaron, Las tonsilas cecales y los sacos ciegos se muestrearon para la presencia o ausencia de S. enteritidis, y se observaron los niveles leucocitarios totales y diferenciales de cada ave. El probiótico a base de B. subtilis disminuyó la colonización de S. enteritidis en el tratamiento B, al analizar los resultados se observó que hubo diferencia significativa (P< 0.05) en las ufc de S. enteritidis en el tratamiento B, se encontró un aumento en el conteo total y diferencial de leucocitos, principalmente en los heterófilos y basófilos del tratamiento A, mientras que en el tratamiento B los valores leucocitarios totales y diferenciales se encontraron dentro del rango normal.
Se concluye que la adición del probiótico a base de B. subtilis (ayuda a evitar la colonización de S. enteritidis y aumenta los niveles de heterófilos y basófilos) se convierte en una medida preventiva de enfermedades entéricas que pueden afectar a los pollos de engorda.
INTRODUCCIÓN
En humanos, la salmonelosis es una de las tres principales enfermedades asociadas con alimentos, desde finales de la década de 1980, la contaminación del pollo y sus productos tales como huevos y productos derivados del huevo, actúan como vehículos de Salmonella enteritidis (SE) (Berthelot et al., 1988). La infección natural de SE ocurre vía oral, la Salmonelosis puede transmitirse de forma vertical u horizontal, los animales y el humano pueden contagiarse por contacto directo o indirecto, ésta coloniza el tracto gastrointestinal y el ciego es la principal parte de la colonización (Ricke, 2003; Kaiser et al., 2006).
El aumento del estrés en el pollo de engorda es el resultado de prácticas modernas tales como: el procesamiento en la incubadora y las altas densidades de población en las granjas de pollos de engorda. Este aumento de estrés puede debilitar la función inmune y así predispone a los pollos de engorda a la colonización del tubo digestivo (TD) por bacterias patógenas como SE y otros microorganismos no favorables, que suponen una amenaza para la seguridad alimentaria (O’Dea et al., 2006).
Para atenuar estas dificultades, las dietas son suplementadas con antibióticos, los cuales han mostrado ser efectivos en la disminución de los trastornos diarreicos y en la promoción del crecimiento animal, sin embargo, el uso indiscriminado de los mismos ha llevado a la aparición de cepas patógenas resistentes. Hoy preocupa el riesgo potencial, por el uso excesivo de los antibióticos en los pollos de engorda. En tal sentido algunas investigaciones han demostrado que los probióticos pueden proporcionar la administración de la misma protección que una microflora comensal del tracto gastrointestinal desarrollada naturalmente (Milián et al., 2008). El uso de probióticos en pollos de engorda ha sido investigado desde la década de los 70’s por Rantala y Nurmi quienes observaron que la exposición de pollos jóvenes a la bacteria con restricción del uso genético de aves maduras tienen protección conferida frente a la infección (Higgins et al., 2007).
Los probióticos son bacterias no patógenas que pueden promover la salud de las aves por reducción de la colonización de patógenos. Esta reducción se atribuye a la exclusión competitiva (EC), incremento en la producción de ácidos grasos volátiles y la potencialización del sistema inmune, así como el incremento de la respuesta humoral en los pollos (Bielke et al., 2007; Higgins et al., 2007). Debido a sus características, Bacillus subtilis (BS), microorganismo gram positivo, cuyo hábitat natural es el suelo, se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, entre sus principales características se encuentra su capacidad para formar esporas en diversas condiciones de estrés, crecer en un intervalo amplio de temperaturas (desde 15° hasta 55°C), presentar motilidad, aerotaxis y velocidades de crecimiento altas, sobrevivir en concentraciones salinas, producir una amplia variedad de antibióticos y enzimas hidrolíticas extracelulares (Espinosa, 2005). Por este tipo de características, se ha usado ampliamente como probiótico., por lo que hasta el momento existen pocas referencias de cómo afecta los parámetros leucocitarios.
Hipótesis. La administración de un probiótico disminuirá la colonización de Salmonella enteritidis y mantendrá los parámetros leucocitarios normales en pollos de engorda.
Objetivo general. Evaluar el efecto de un probiótico administrado vía oral sobre la colonización de Salmonella enteritidis en pollos de engorda y sus parámetros leucocitarios.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de las unidades formadoras de colonias de S. enteritidis. Para este experimento la SE se colocó en viales de plástico de 1mL, de los cuales dos viales se cultivaron en 250 mL de caldo tríptico de soya por 24 h en un matraz de 500 mL, éste se colocó en una estufa de cultivo bacteriológico a 37°C durante 24 h para su reproducción, posteriormente las bacterias fueron colocadas en cuatro tubos de plástico estériles de 13 mL llenándolos sólo hasta la marca de 12 mL cada uno, para inmediatamente colocarlos dentro de la centrífuga de la marca Hettich modelo EBA 20 y se realizó una centrifugación a 3,000 revoluciones por minuto (RPM) durante 15 minutos, se retiró el sobrenadante de cada tubo para dejar sólo el sedimento, al cual se le agregó solución salina fisiológica (SSF) al 0.9% hasta obtener la cantidad de bacterias necesarias, las cuales fueron determinadas con el kit de McFarland de la marca Biomerieux para obtener la dosis de 106 ufc/0.25 mL (Wolfenden, 2007).
DISEÑO EXPERIMENTAL
Todos los pollos fueron aleatoriamente asignados a dos grupos de tratamiento (15 pollos/grupo), se desafiaron con una jeringa de 1 mL con aguja esofágica de acero inoxidable de la marca Luer Lock (0.25 mL) con 106 ufc de SE colocadas en el esófago de cada pollo y después los pollos se colocaron en dos jaulas con cama de papel periódico previamente desinfectado. Una hora después de haber sido tratados con SE, se les administró al tratamiento B el probiótico, usando una jeringa de 1 mL y una aguja esofágica de acero inoxidable de la marca Luer Lock con 106 ufc de BS/pollo (1 mL) cada 24 h durante tres días y SSF de la marca Pisa al grupo control o tratamiento A (Menconi et al., 2010).
A las 72 h después de la administración del probiótico 1 ml de sangre fue tomada en una jeringa de 1 ml con una aguja del 27 g por medio de punción cardiaca de 10 pollos de cada grupo y las muestras se colocaron en microtainers que contenían el anticoagulante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para el estudio. Se sacrificó cada ave de acuerdo con la NOM- 033-ZOO-1995 (SAGARPA, 2012).
Las tonsilas cecales de 10 pollos de cada tratamiento se obtuvieron asépticamente en la campana de extracción previamente esterilizada, usando dos mecheros de Bunsen para mantener la esterilidad de la zona, las tonsilas cecales se colocaron en tubos de vidrio de 20 ml enriquecidos cada uno con 10 ml de caldo de tetrationato, se incubaron durante 24 horas a 37°C en una estufa de cultivo bacteriológico, posteriormente asépticamente se tomaron muestras con un mango de acero inoxidable y se sembraron en 20 cajas de petri con agar verde brillante que contenía 25 ug/ml de NO y 20 ug/ml de NA.
Las cajas de Petri se incubaron a 37°C durante 24 h en la estufa bacteriológica y se examinaron por propagación en placa para la presencia o ausencia de SE resistente a NO y NA. Los sacos ciegos se colocaron en bolsas de plástico estériles, se les añadieron 10 ml SSF a cada bolsa y posteriormente se maceró el contenido de cada una, para después hacer diluciones seriadas en placas de plástico de 90 pocillos utilizando una micropipeta para obtener las diluciones de 105, 104, 103, 102 cada uno de diluciones de muestras se sembraron en cajas de Petri de vidrio con agar verde brillante que contiene 25 ug/ml de NO y 20 ug/ml de NA, cada caja se cuadriculó en la parte posterior del agar, lo que nos indicó dónde colocar cada gota de dilución. Las cajas de petri se incubaron a 37°C en la estufa de cultivo bacteriano durante 24 h y el total de unidades formadoras de colonias de SE fueron determinadas a partir de propagación en placa a través de conteo manual (Wolfenden, 2007).
La incidencia de la SE recuperada en los experimentos se analizó con la prueba de la t de Student (Steel y Torrie, 1990) utilizando un diseño completamente al azar para determinar la diferencia estadística (P <0,05) entre el grupo control y el grupo del tratamiento probiótico. A los diferentes valores de leucocitos se les aplicaron la misma prueba. Las ufc recuperadas de los sacos ciegos se convirtieron en log10 y la comparación de éstos se realizó con el programa estadístico Statistix 9 for Windows para analizar los resultados finales del experimento (Analytical Software, 1998).
RESULTADOS
Los valores encontrados en el recuento total de leucocitos fueron estadísticamente superiores (P<0.05) en el tratamiento que no recibió el probiótico, el cual obtuvo 34.260 ± 1.249 leucocitos/μL , contra 27.160 ± 1.331 leucocitos /μL del tratamiento que recibió el probiótico, con una diferencia de 7.100 leucocitos/μL. La recuperación bacteriana a las 72 horas, fue mayor estadísticamente (P <0.05) en el tratamiento que no recibió probiótico, donde se observó una diferencia superior a 2.52 ufc de SE log10. La invasión de SE en las tonsilas cecales se puede observar en la Tabla 1, donde el tratamiento B obtuvo la menor incidencia (reducción de 60%), mientras que el tratamiento A fue de mayor incidencia bacteriana.
El valor total de heterófilos fue superior estadísticamente (P <0.05) en el tratamiento que no recibió el probiótico, donde se observó una diferencia de 15.80% de heterófilos con respecto al tratamiento que recibió el probiótico. El valor total de linfocitos fue estadísticamente superior (P <0.05) en el tratamiento que recibió el probiótico, donde se observó una diferencia de 17.20% de los linfocitos con respecto al tratamiento que no recibió el probiótico. En el valor total de eosinófilos en ambos tratamientos (tratamientos A y B) no hubo diferencias significativas (P <0.05), donde se observó una diferencia de 0.20% entre los tratamientos. El valor total de los basófilos fue estadísticamente superior (P <0.05) en el tratamiento que no recibió el probiótico, donde se observó una diferencia de 1.20% con respecto al tratamiento que recibió el probiótico, como se observa en la Tabla 2. En el conteo diferencial de los monocitos de ambos tratamientos (Tratamiento A y B) no se encontraron valores para establecer un análisis estadístico.
CUADRO 1. Recuento total de leucocitos, conteo total de unidades formadoras de colonias y presencia de SE en las aves del tratamiento A versus el tratamiento B, a las 72 h post infección.
Tratamiento A =106 ufc/SE en 0.25 mL vía oral y sin probiótico. Tratamiento B =106 ufc/SE en 0.25 mL vía oral y 106 ufc/BS en 1 mL vía oral cada 24 h por tres días. ab Letras distintas en la misma columna indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). E.E.: Error estándar.
CUADRO 2. Conteo diferencial de heterófilos, linfocitos, eosinófilos y basófilos expresado en valores porcentuales, en las aves del tratamiento A y B, a las 72 horas post infección. Tratamiento Heterófilos
Tratamiento A =106 ufc/SE en 0.25 mL vía oral y sin probiótico. Tratamiento B =106 ufc/SE en 0.25 mL vía oral y 106 ufc/BS en 1 mL vía oral cada 24 h por tres días. ab Letras distintas en la misma columna indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). E.E.: Error estándar.
DISCUSIÓN
Se aceptó la hipótesis alternativa al encontrar que la administración de BS disminuyó significativamente la colonización de SE en los pollos de engorda del tratamiento B, y al encontrar un aumento en el conteo total y diferencial de leucocitos, principalmente en los heterófilos y basófilos del tratamiento A, mientras que en el tratamiento B los valores leucocitarios totales y diferenciales se encontraron dentro del rango normal lo cual es muy similar en lo encontrado por Ruiz, et al., (2008) donde el conteo diferencial de leucocitos en los pollos infectados con S. enteritidis fagotipo 13a (SE FT 13a) a los cuatro días de edad post infección (poi), presentó un porcentaje de linfocitos de 41.25%, el porcentaje de heterófilos se observó aumentado un 25% de lo normal, el porcentaje de los eosinófilos fue de 0%, por otra parte los basófilos se encontraron aumentados en un 10%. Por último, los monocitos también estuvieron aumentados con un valor de 15% del rango normal.
CUADRO 3. Conteo diferencial de heterófilos, linfocitos, eosinófilos y basófilos expresados en valores absolutos, en las aves del tratamiento A y B, a las 72 horas post infección.
Tratamiento A =106 ufc/SE en 0.25 mL vía oral y sin probiótico. Tratamiento B =106 ufc/SE en 0.25 mL vía oral y 106 ufc/BS en 1 mL vía oral cada 24 h por tres días. ab Letras distintas en la misma columna indican diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). E.E.: Error estándar.
En el tratamiento B los valores leucocitarios totales y diferenciales se encontraron dentro del rango normal de acuerdo a lo mencionado por Charles (2003), quien estableció los valores leucocitarios de referencia para pollo de engorda del nacimiento a la primer semana de edad, donde los rangos estándar son similares a los valores encontrados en el tratamiento adicionado con el probiótico, mientras que el conteo total y diferencial leucocitario del tratamiento al cual no se le adicionó el probiótico se encuentra por encima de los valores estándar, principalmente en los heterófilos y basófilos con lo que se demuestra que existe una leucocitosis provocada por la infección de S. enteritidis en el tratamiento sin probiótico por lo que el sistema inmune aviar necesita aumentar la producción de los leucocitos mencionados anteriormente para combatir la infección presente en las aves de engorda.
Menconi et al. (2010), en su estudio encontró que el tratamiento con probiótico redujo significativamente la incidencia de Salmonella enterica serotipo Heidelberg (SH) en tonsilas cecales a las 24 y 72 h en los pollos de engorde con el probiótico (Flora En el tratamiento B los valores leucocitarios totales y diferenciales se encontraron dentro del rango normal de acuerdo a lo mencionado por Charles (2003), quien estableció los valores leucocitarios de referencia para pollo de engorda del nacimiento a la primer semana de edad, donde los rangos estándar son similares a los valores encontrados en el tratamiento adicionado con el probiótico, mientras que el conteo total y diferencial leucocitario del tratamiento al cual no se le adicionó el probiótico se encuentra por encima de los valores estándar, principalmente en los heterófilos y basófilos con lo que se demuestra que existe una leucocitosis provocada por la infección de S. enteritidis en el tratamiento sin probiótico por lo que el sistema inmune aviar necesita aumentar la producción de los leucocitos mencionados anteriormente para combatir la infección presente en las aves de engorda.
Menconi et al. (2010), en su estudio encontró que el tratamiento con probiótico redujo significativamente la incidencia de Salmonella enterica serotipo Heidelberg (SH) en tonsilas cecales a las 24 y 72 h en los pollos de engorde con el probiótico (Flora max), obteniendo una media de 0.27 x 1010 ufc a las 24 h y 0 ufc a las 72 h, de SH y con el grupo control una media de 3.44 x 1010 ufc a las 24 h y 2.96 x 1010 ufc a las 72 h, de SH.
Estos datos demuestran que la administración de probióticos 1 hora después de la administración de SH, redujo significativamente la incidencia en las tonsilas cecales de pollos de engorde en comparación con los controles no tratados a las 24 y 72 h después del tratamiento, lo que es similar a lo encontrado en los resultados del presente experimento.
En las cajas de agar verde brillante el tratamiento A se obtuvo un 100% de colonización de SE, mientras que en el tratamiento B se obtuvo un 40% de colonización de SE lo que es un poco menor a lo encontrado por Pérez (2010) que indica que la adición del probiótico a base de esporas de BS en el agua de bebida es benéfico para los pollos de engorda infectados con SG, ya que en su experimento el grupo que no recibió el probiótico tuvo un 40% colonización y en el tratamiento con probióticos a base de esporas de BS obtuvo un 0% de colonización.
Se encontraron diferencias estadísticas entre el tratamiento A y el tratamiento B, así mismo Vila, et al. (2009) obtuvo resultados similares pero en diferente etapa de crecimiento del pollo de engorde, de las aves inoculadas, sólo las aves infectadas a los 7 días y sin tratar tenía una tasa de infección tardía de 100% en 28 y 42 días, mientras que las aves infectadas también a los 7 días, pero tratados con el probiótico obtuvieron una tasa de infección del 50% a los 28 días, y de 0% a 42 días al suplementar el alimento de pollos de engorda con un probiótico de B. cereus var. Toyoi (BCT) para prevenir la colonización de SE.
Menconi (2010), en su estudio encontró que el tratamiento con probiótico redujo significativamente la incidencia de SH en tonsilas cecales en los pollos de engorde con el probiótico (Flora Max), obteniendo 5.2% a las 24 h y 0% a las 72 h de aves positivas a ufc de SH. Estos datos demostraron que la administración de probióticos 1 h después de la administración de SH, redujo significativamente la incidencia en las tonsilas cecales de pollos de engorde en comparación con los controles no tratados que obtuvieron 90% a las 24 h y 35% a las 72 h de aves positivas a SH, lo que es un poco menor a lo encontrado durante el presente experimento. Por otra parte Vila, et al., (2009) encontraron que el probiótico BCT aumenta la proliferación de Lactobacillus spp., mejorando el equilibrio de la microflora intestinal de los pollos de engorda neonatales, por lo que puede que BS actúe de manera similar.
No se conoce a ciencia cierta cuál es el mecanismo exacto de los probióticos pero se puede decir que primero necesitan pasar por el estómago y proliferar en el tracto digestivo para establecerse exitosamente en el mismo; donde con ayuda del bajo pH, bajo potencial redox, las sustancias inhibitorias, la competencia por los nutrientes y la adhesión a sitios receptores específicos de bacterias como SE (Pérez, 2010), tomando en cuenta lo anterior puede que las esporas de BS actúen de esta manera y así disminuyan la invasión y colonización de SE en los pollos de engorda.
CONCLUSIONES
Se determinó que la administración adecuada de 106 ufc del probiótico a base de esporas de BS administrado vía oral cada 24 h durante 3 días demostró ser eficaz para disminuir la colonización de SE dentro del tracto gastrointestinal, por lo que al no presentarse la infección dentro del organismo el sistema inmune mantiene los niveles leucocitarios normales, por lo tanto la adición del mismo se convierte en una medida preventiva para la SE que afecta a los pollos de engorda.
REFERENCIAS
1. Analytical software. 1998. Statistix 9 for window, Borland international, Inc. 1- 327.
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4. Charles, M. V., 2003. Manual de hematología aviar. Universidad Nacional Autónoma de México., p 71. 5. Espinosa, J.J., 2005. Caracterización del proceso de crecimiento de Bacillus subtilis bajo condiciones anaerobias. Tesis de doctorado en biotecnología. Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Morelos.
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7. Kaiser, M.G., Cheseman, J.H, Kaiser, P., and Lamont, S.J., 2006. Cytokine Expression in Chicken Peripheral Blood Mononuclear Cells After in Vitro Exposure to Salmonella enterica serovar Enteritidis. Poultry Science 85:1907 -1911.
8. Menconi, A., Wolfenden, A.D., Shivaramaiah, S., Terraes, J. C., Urbano, T., Kuttel, J. Kremer, C., Hargis, B.M. and Tellez, G. 2010. Effect of lactic acid bacteria probiotic culture for the treatment of Salmonella enterica serovar Heidelberg in neonatal broiler chickens and turkey poults. Poultry Science 90: 561–565.
Artículo publicado en Los Avicultores y su Entorno Octubre- Noviembre
